Corno di cervo: un modello per la rigenerazione del tessuto scheletrico

di Alberto Regis
corna di cervo cellule staminali

Nuove intuizioni fisiologiche sui fenomeni del corno di cervo: un modello unico per la rigenerazione del tessuto scheletrico

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Generalmente, i mammiferi non sono in grado di rigenerare tessuti e organi complessi, tuttavia il corno di cervo fornisce una rara anomalia a questa regola.

Questa appendice cranica ossea, che si trova sull'osso frontale del cervo maschio, è in grado di organogenesi basata sulle cellule staminali

Una serie di studi recenti ha classificato questa forma di rigenerazione come basata sulle cellule staminali epimorfiche.

Il rinnovo delle corna è avviato dall'attivazione delle cellule periosteali del pedicolo derivate dalla cresta neurale (PPC) che risiedono all'interno del periosteo del pedicolo (PP), questi PPC hanno il potenziale per differenziarsi in più lignaggi.

Altre cellule staminali delle corna (ASC) sono le cellule mesenchimali di riserva (RMC) situate nella punta delle corna, che si sviluppano in tessuto cartilagineo.

Le cellule periosteali antlerogeniche (APC) che si trovano all'interno del periosto antlerogeno (AP) formano i tessuti sia del peduncolo che del primo insieme di corna.

Le cellule staminali delle corna (ASC) sembrano ulteriormente progredire attraverso vari stadi di attivazione, questa transizione coordinata è considerata imperativa per la rigenerazione dei mammiferi basata sulle cellule staminali.

Gli ultimi sviluppi hanno dimostrato che il rapido allungamento del fascio principale e dei rami delle corna sono una forma controllata di crescita tumorale, regolata dai geni soppressori del tumore TP73 e ADAMTS18. Sono coinvolte anche sia l'osteoclastogenesi, sia la differenziazione osteogenica e condrogenica.

Mentre c'è ancora molto da scoprire, questa revisione riassume e valuta in modo completo la nostra conoscenza esistente della rigenerazione dei tessuti nella corna del cervo.

Ciò aiuterà a raggiungere l'obiettivo della rigenerazione degli organi in vitro nell'uomo promuovendo il campo della moderna medicina rigenerativa.

Come processo unico di rigenerazione degli organi basato sulle cellule staminali nei mammiferi, le corna di cervo rappresentano un sistema modello di primo livello per studiare i meccanismi di rigenerazione nei tessuti dei mammiferi.

I nuovi ASC potrebbero fornire terapie basate su cellule per la medicina rigenerativa e il rimodellamento osseo per l'applicazione clinica.

Una maggiore comprensione di questo processo e una definizione più approfondita degli ASC potenzieranno migliori risultati clinici.

Parole chiave

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Introduzione

La rigenerazione dei tessuti è il processo fisiologico attraverso il quale i tessuti si riparano o si sostituiscono, consentendo la ricrescita di organi e strutture corporee associate all'invecchiamento o alle lesioni [45].

La rigenerazione fisiologica, come la sostituzione stagionale delle corna di cervo, avviene per il mantenimento dell'omeostasi durante la vita di un organismo; mentre la rigenerazione riparativa avviene in risposta alla lesione [45].

La base del rinnovamento dei tessuti nella maggior parte delle specie dipende dalla proliferazione e dalla differenziazione delle cellule staminali [28,79,104]. I progressi nella biologia delle cellule staminali hanno dimostrato che le popolazioni regionali di cellule staminali risiedono all'interno di microambienti anatomici specializzati e istruttivi, chiamati "nicchie" [93,98], e sono regolate da segnali esterni dalla matrice extracellulare (ECM) e segnali interni controllati dall'espressione genica intracellulare [20].

La capacità del tessuto rigenerativo varia tra organi, organismi e specie [89].

Ad esempio, l'axolotl, un anfibio urodele, ha stupito i ricercatori per la sua straordinaria capacità rigenerativa ed è in grado di far ricrescere un midollo spinale, un cuore e interi arti fino all'età adulta [96]. In confronto, i mammiferi possiedono una capacità rigenerativa di organi e tessuti molto limitata rispetto ai vertebrati inferiori. Inoltre, la capacità dei tessuti dei mammiferi di rigenerarsi generalmente diminuisce fino all'età adulta, insieme alla ridotta capacità rigenerativa delle cellule staminali [117].

Le corna di cervo sono un'appendice cranica unica appartenente alla filogenesi Cervidae e hanno proprietà notevoli che consentono la loro rigenerazione periodica per tutta la vita di un individuo. Tassi di crescita rapidi di circa 1,7 cm/giorno e generando fino a 30 kg di tessuto osseo entro pochi mesi, sono riportati per le corna di cervo, che superano la crescita di alcuni tessuti cancerosi [92.112].

Così l'interazione fenomenale dei fattori di crescita cellulare e dei sistemi fisiologici che regolano questo processo ha portato alla creazione di corna di cervo come modello per il progresso della medicina rigenerativa. I recenti progressi hanno identificato questa ricrescita ciclica come un processo basato sulle cellule staminali epimorfiche rispetto alla rigenerazione attraverso la formazione di un blastema [59,68]. Al contrario, la rigenerazione epimorfica mediata dal blastema ha un'ima impengente sulla proliferazione e l'accumulazione di cellule progenitrici localizzate che sono confinate in un lignaggio specifico [45].

Gli studi di antler in vitro hanno isolato e coltivato con successo nuove cellule staminali di corna (ASC) trovate all'interno del periostio antlerogenico (AP), del periosteo del pedicolo (PP) e del mesenchima di riserva (RM) che sono cruciali per la rigenerazione dei tessuti. Gli esami istologici e morfologici hanno anche mostrato la presenza di più tipi di tessuto all'interno della regione di crescita del corno [61].

Lo scopo di questa revisione è chiarire l'attuale comprensione dei processi biologici alla base della rigenerazione dei tessuti nelle corna di cervo e valutare la traiettoria futura di questa ricerca.

Scoprire la base molecolare e le origini evolutive della rigenerazione tissutale nei cervi non solo ci permetterà di comprendere meglio il processo specializzato di rigenerazione tissutale nell'uomo, ma aiuterà anche negli interventi terapeutici per il cancro e nella riparazione delle ossa e della cartilagine.

Istogenesi del pedicolo e sviluppo del primo corno

Le corna di cervo sono escrescenze accoppiate di vero osso trovato sulla fronte dei cervi maschi, che sono ricoperte esternamente da uno strato di pelle simile a capelli noto come velluto.

A differenza della normale pelle del cuoio capelluto di cervo, il velluto contiene un'epidermide ispessita, ghiandole sebacee più grandi e uno straordinario potenziale di espansione [36]. Le corna crescono direttamente dai pedicoli, una protuberanza permanente dell'osso frontale, che fornisce la base per la crescita delle corna [10,60]. Gli esperimenti di delezione e inserimento hanno dimostrato che senza il peduncolo, non avviene una successiva crescita delle corna [38], suggerendo che è l'osso del pedicolo che dà origine ai tessuti del corna e quindi evidenziando il suo significato [64]. Sia il pedicolo che le corna sono avvolti nel periostio, una membrana spessa situata sulla superficie dell'osso [37].

Questo strato di tessuto funziona per sostenere la crescita e la riparazione delle ossa [25]. Il pedicolo e il corno sono strutturalmente composti da tessuto fibroso, osso, cartilagine, nervi e vasi sanguigni [8,59,60,92]. Lo sviluppo e l'istogenesi dei pedicoli si verificano alla pubertà durante il primo anno di vita, e i tempi di questo processo variano tra le diverse specie di cervi; [52]. I meccanismi di formazione del peduncolo sono in gran parte sconosciuti, tuttavia è noto che il pedicolo proviene dall'AP [67]. Questo è un tipo speciale di periosteo situato in una regione distinta dell'osso frontale [67]. Ha un diametro di circa 2,5 cm, uno spessore di 0,25-0,30 cm ed è stato proposto come un tessuto embrionale mantenuto postnatale [67];. La formazione della corna (il primo insieme) avviene dopo la nascita all'età di un anno, è anche derivata dall'AP [50].

Le corna di cervo maschio sono usate per il combattimento e l'esposizione, e si pensa che la loro crescita ciclica sia legata al ciclo riproduttivo. Durante la rigenerazione delle corna, si pensa che un aumento del livello di testosterone sistemico inizi l'istogenesi del pedicolo e fornisca il segnale di attivazione per le cellule periosteali antlerogeniche (APC) nell'AP (Fig. 1). Tuttavia, i risultati sperimentali indicano che il ruolo degli ormoni sessuali nella regolazione del ciclo e della differenziazione degli APC è complesso e possibilmente modulato dall'effetto di segnali aggiuntivi degli ormoni, come gli estrogeni. Ulteriori ormoni non sessuali sembrano anche influenzare la crescita ciclica delle corna, come la vitamina D, gli ormoni tiroidei e il cortisolo [13,101,103,105,108]. L'AP presenta profonde proprietà rigenerative e genetiche continuando a far crescere il tessuto delle corna dopo il trapianto ectopico e con la generazione di interi vitelli di cervo clonati dal processo di trasferimento nucleare delle cellule somatiche (SCNT) [8,37]. Le proprietà rigenerative e il potenziale genetico degli APC (e degli ASC) sono ulteriormente dimostrati dalla loro capacità di formazione di organi di corno di cervo, dalla loro espressione di marcatori di cellule staminali mesenchimali (MSC) (CD73, CD90, CD105 e Stro-1), dalla differenziazione osteogenica del lignaggio e dagli attributi parziali delle cellule staminali embrionali (ESC). Gli APC hanno la capacità di dare origine a organi e tessuti di mammiferi, tra cui la pelle, il sangue, i nervi, gli occhi, la cartilagine, il tessuto connettivo e l'osso [8]. Il potenziale per la generazione di corna esogena da parte del pedicolo e degli APC è stato studiato con un approccio di xenoinnesto in vivo nei topi, che ha dimostrato che la formazione di corna richiede un'interazione reciproca del pedicolo e della pelle di cervo sovrastante [97]. Mentre il trapianto dell'AP in una testa di topo nuda provoca la formazione di un peduncolo ectopico di dimensioni proporzionali, la pelle del topo non era in grado di indurre la formazione di corna [63]. Il modello di trapianto di topo nudo di Li et al. [97], è considerato di qualità inferiore ed è altamente suscettibile agli errori, nonostante le sue conclusioni convincenti sulle interazioni tissutali eterotipiche coinvolte nell'antlerogenesi e nella formazione di pedicoli. Tuttavia, non è chiaro se l'interazione tra i due tipi di tessuti (AP e pelle di cervo) sia necessaria per l'inizio della formazione del pedicolo o per sostenere la sua crescita.

 

  • Figura 1. Tipi di potenziali cellule staminali del corno. Le cellule periosteali antlerogeniche (APC) si trovano all'interno del periosteo antlerogenico (AP), queste cellule funzionano nel pedicolo e nella formazione delle prime corna. Le cellule staminali mesenchimali di riserva (RMC) si trovano nella punta di crescita delle corna e formano il tessuto cartilagineo del corno rigenerante. Le cellule periostee del pedicolo (PPC) sono localizzate all'interno del periosteo del pedicolo (PP) e formano il centro di crescita delle corna (AGC).

Si pensa che lo sviluppo del pedicolo avvenga in quattro fasi, il primo stadio è l'ossificazione intramembranosa per cui gli APC reclutati proliferano e si differenziano in cellule osteoblast-lineage [66,92]. Queste cellule osteoblastiche formano successivamente l'osso trabecolare del periosto sotto la regolazione dei geni, tra cui l'osteocalcina (OCN) o la proteina secreta acida e ricca di cisteina (SPARC), fattore di crescita trasformante beta-1 (TGFβ-1) e S100A4 [62,92]. Il secondo stadio si verifica una volta che il peduncolo ha raggiunto 5-10 mm di lunghezza ed è chiamato ossificazione di transizione [92]. In questa fase gli APC si differenziano in condrociti formando il tessuto osseocartilagino interno del pedicolo [92]. Il terzo stadio è l'ossificazione endocondrale in cui la condrogenesi avviene esclusivamente nel pedicolo [92]. Nella fase finale della formazione del pedicolo, gli APC sostengono la loro via di differenziazione condrogenica fino al completamento della prima formazione di corna, chiamata ossificazione endocondrale delle corna [92].

Sebbene gli APC siano stati anatomicamente e istologicamente ragionevolmente ben caratterizzati, i fattori di crescita specifici, le vie di segnalazione e i geni che regolano il loro auto-rinnovo, la proliferazione e la differenziazione durante lo sviluppo delle corna e del pedicolo non sono stati completamente determinati [8]. Gli studi in vitro hanno dimostrato che il fattore di crescita insulino-simile-I (IGF-I), un ormone prodotto nel fegato, potrebbe avere un ruolo nella formazione e nella crescita del pedicolo e delle prime corna e sembra stimolare la proliferazione e la differenziazione dell'APC durante ogni fase di ossificazione [92,97.106]. L'acido retinoide (RA), un derivato della vitamina A, sembra svolgere un ruolo importante nella regolazione della formazione, della crescita e dello sviluppo del pedicolo delle corna di cervo e potrebbe potenzialmente aumentare il tasso di proliferazione degli APC in vivo [48]; [2,3]; [90]. L'analisi del proteoma e delle vie di segnalazione molecolare degli ASC ha rilevato che diverse vie, tra cui PI3K/Akt, ERK/MAPK e p38 MAPK sono attivate durante la proliferazione, così come i fattori di trascrizione ESC, come POU5F1, SOX2, NANOG e MYC [62]. La caratterizzazione del proteoma del corno di cervo in crescita ha identificato circa 130 proteine distinte e indica la necessità di ulteriori ricerche per determinare e scoprire percorsi regolatori vitali dello sviluppo del corno [86].

Le caratteristiche morfologiche delle corna di cervo variano tra le specie. Ad esempio, la lunghezza del pedicolo nel cervo Sika (Cervus nippon) crescerà tra 40 e 50 mm, mentre nel cervo rosso (Cervus elaphus) la sua lunghezza varia tra 50 e 60 mm [33.63]. La crescita alla punta primaria della corna sembra verificarsi una volta che il pedicolo raggiunge una certa soglia specifica della specie e può coincidere ampiamente con una diminuzione del livello individuale di testosterone [51]. In questa fase, tra le specie, presumibilmente in risposta alle richieste funzionali, si verifica un cambiamento nella composizione della pelle dalla pelle del cuoio capelluto del pedicolo al velluto [60]. Queste corna primarie sono molto più piccole e non ramificate rispetto alle corna rigenerate stagionalmente, i cui rami laterali e complessità tendono ad aumentare con l'età tra le specie [10,52,60]. Collettivamente, i risultati indicano che la crescita delle prime corna e delle successive corna stagionali o secondarie è regolata da una combinazione di interazione meccanica tra il tessuto antlerogenico e la pelle sovrassa e meccanismi di comunicazione intercellulare e di segnalazione molecolare potenziati da ASC [60,63,71]. Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire le caratteristiche istogenetiche specifiche della specie della formazione, della crescita e dello sviluppo delle corna di cervo.

L'anatomia e la fisiologia della rigenerazione del tessuto delle corna

La ricrescita delle antina è stata anatomicamente ben descritta da diverse pubblicazioni [92];. A seguito di un ampio dibattito e di un'ampia ricerca, questa forma di rigenerazione tissutale è considerata basata sulle cellule staminali [4,59,68]. La ricrescita ciclica delle corna sembra essere coordinata con il ciclo riproduttivo e regolata sia dal sistema endocrino che da vari fattori ambientali (Fig. 2) [57]. I meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione basata sulle cellule staminali delle corna, come le interazioni tra i fattori localizzati, endocrini e ambientali, sono in gran parte sconosciuti. La rigenerazione inizia ogni anno in tarda primavera in seguito alla fusione delle precedenti corna "dure", che sono essenzialmente ossa morte, in coincidenza con il ciclo del testosterone [37,88,105];. La colata di corna comporta lo spargimento del velluto e del periosteo sovrastanti, la mineralizzazione dell'osso del corno esistente e il riassorbimento dell'osso osteoclastico nel peduncolo distale alla linea di ascissione tra il pedicolo e il corno [39,54];. Gli studi osservazionali indicano che immediatamente dopo la colata delle corna, il pedicolo sanguina sostanzialmente e una crosta che copre circa la metà della superficie fusa viene prodotta entro 1-2 giorni, che alla fine viene levigata dall'attività osteoclastica all'interno del pedicolo distale [39]. Un anello gonfio di pelle contenente una superficie esterna lucida nota come "epitelio ferito", e costituito da cellule epidermiche e di derivazione mesodermica, successivamente migra per coprire il ceppo del pedicolo, che funge da primo indicatore di ricrescita delle anna [39]. Si pensa che il bocciolo del corno che si ramifica e si allunga derivi dai tessuti del moncone del pedicolo/PP [39,59]. I precisi meccanismi cellulari che influenzano le prime fasi della rigenerazione delle corna (~14 giorni) devono ancora essere chiariti ed evidenziano un'area vitale della ricerca futura. Durante l'inizio dell'estate la rapida crescita longitudinale, del tessuto osseo del fascio principale e dei rami laterali, denominati "tini", si verifica a un tasso di crescita sorprendente di circa 2,75 cm/giorno [54];, che coincide con bassi livelli di testosterone circolante, inattività riproduttiva del cervi e un abbondante approvvigionamento alimentare [36]. Durante questo periodo di crescita, le corna vengono avvolte da un tegumento che fornisce al corno in crescita sangue dalle arterie del suo strato vascolare ed è fondamentale per le esigenze metaboliche del tessuto rigenerante [30]. Il tegumento è altamente innervato dalle fibre sensoriali del nervo trigemino, i cui esoni crescono a un ritmo che accompagna quello del corno (2 cm/giorno) [83];. La rapida crescita dell'osso del corno avviene attraverso una combinazione di ossificazione endocondrale modificata all'interno di ciascuna punta distale delle corna dopo la formazione della cartilagine e ossificazione intramembranosa all'interno dell'albero che aumenta il diametro dell'anta [6,54]. L'ossificazione endocondrale modificata comporta un ampio riassorbimento della cartilagine mineralizzata da parte delle cellule di osteoclasti o condroblasti [30], seguita dalla secrezione della matrice ossea da parte degli osteoblasti e dalla successiva mineralizzazione. I risultati in vitro suggeriscono che le cellule multinucleate simili agli osteoclasti delle corna (MNC) sono fenotipicamente paragonabili agli osteoclasti dell'osso dei mammiferi, come esemplificato dalla loro espressione di fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) con attività risortiva del tessuto mineralizzato [30]. Tuttavia, le condizioni di coltura fornite dalle cellule di cartilagine non mineralizzate delle corna erano sufficienti per indurre la differenziazione osteoclastica delle MNC e l'espressione di fattori normalmente richiedeva la forosteoclastogenesi, l'attivatore del recettore del fattore nucleare-kappa B (RANKL) e il fattore stimolante delle colonie di macrofagi (M-CSF) [30]. Inoltre, la differenziazione degli osteoclasti nel tessuto rigenerante delle corna di cervo sembra essere regolata dalla segnalazione della proteina correlata all'ormone paratiroideo (PTHrP)/repth(rP) (PPR) [29], dal riccio indiano (IHH) e dal fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF-β1) [31]. Quando la stagione del rutting si avvicina a fine estate/autunno, le corna in via di sviluppo rimangono attaccate al pedicolo, il loro afflusso di sangue e nervi si ritira e le corna subiscono una completa mineralizzazione e maturazione [72]. Sono necessarie ulteriori ricerche per studiare i processi unici di mineralizzazione e rimodellamento dell'osso e della cartilagine, comprese le vie di differenziazione cellulare e di segnalazione, che influenzano la rigenerazione delle corna di cervo.

 

Figura 2. Cronologia delle diverse fasi della rigenerazione delle corna di cervo (A) Primavera - Casting (B) Estate - Crescita longitudinale (C) Autunno - Sviluppo completo e calcificazione (D) Inverno - Le corna dure rimangono attaccate al pedicolo. AP.

Il centro di crescita delle corna (AGC), situato sulla punta del corno, è un centro di crescita primario [97]; [90]. Studi morfologici e istologici indicano che l'AGC è costituito da quattro zone distinte [97]; [90], che possono essere considerate per ricapitolare le zone distali dell'osso lungo endocondrale embrionale differenziante. In ordine distoprossimale, queste zone sono le zone di proliferazione, maturazione, ipertrofia e calcificazione [61]. All'interno della zona di proliferazione (dove avviene la maggior parte della crescita delle corna), possono essere individuati tre tipi principali di tessuto: il mesenchima di riserva (RM), la pre-cartilagine (PC) e la cartilagine (CA) [5,61], sebbene la ripartizione tra questi tessuti potrebbe non essere chiaramente definita istologicamente, a causa della loro immensa vascolarizzazione [53]. Li et al. utilizzando tecniche di campionamento standardizzate hanno dimostrato in modo rapido e accurato che questi strati tissutali sembrano essere strutturalmente e funzionalmente distinti e variano nell'espressione genica [61]. L'identificazione di questi tipi di tessuto altamente organizzati all'interno della punta delle corna potrebbe fornire nuove intuizioni rigenerative consentendo future analisi molecolari e funzionali [61]. Le cifre incluse nello studio Li.et al., tuttavia, consentono solo la visualizzazione a livello microscopico [65]. Inoltre, i metodi/protocolli di dissezione dei tessuti stabiliti sono specifici per le specie di cervi rossi, limitando la loro riproducibilità [61].

La rapida crescita sulla punta delle corna di cervo è sostenuta da popolazioni distinte di ASC. Le cellule staminali mesenchimali di riserva (RMC) all'interno della RM subiscono una proliferazione intensa e sequenziale [83]; [112,114,115], mediata da segnali provenienti da fattori di crescita, tra cui melatonina e IGF-1 [118,119]. La differenziazione condro/osteogenica degli RMC è regolata dalla maggiore espressione di geni che sono caratteristici della robusta cartilagine dei mammiferi e dello sviluppo osseo, tra cui il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), TGF-β, Wnt e proteine morfogenetiche ossee (BMP) [41,92]. Le cellule derivate dal pericondro (PER) sono progenitori multipotenziali che si trovano all'interno del pericondro, uno strato di tessuto fibroso continuo con il periosteo che è il sito della formazione ossea intramembranosa; [92]. A differenza degli RMC, le cellule PER in vitro sono state trovate per esprimere alti livelli di mRNA e proteine di collagene di tipo I, un marcatore fenotipico per le cellule del lignaggio osteoblastico; [90], tuttavia, i loro bassi livelli dell'enzima fosfatasi alcalina (ALP) sono indicativi di uno stato pre-osteoblastico [92].

Gli studi morfologici e istologici sulla rigenerazione delle corna hanno documentato l'importanza delle cellule staminali all'interno del PP, chiamate cellule periosteali del pedicolo (PPC). Durante la rigenerazione annuale delle corna, i PPC vengono reclutati per la proliferazione e la differenziazione per la formazione del tessuto delle corna [59];. I PPC sono un tipo multipotente di ASC, che sono relativamente pochi numerici e risiedono esclusivamente all'interno del PP, un derivato di membrana dell'AP; [59]. La membrana PP si trova lungo il bordo del ceppo del pedicolo e sotto il velluto appena cresciuto, sviluppandosi dalla differenziazione di circa 5 milioni di APC. Durante la fase iniziale di guarigione della ferita dopo la colata delle corna, il PP situato al pedicolo distale si ispessisce notevolmente. Questo ispessimento è indicativo dell'alta attività proliferativa dei PPC. Wang et al., hanno condotto le prime caratterizzazioni molecolari complete del lignaggio ASC (PPC, RMC e APC), e i risultati di questo studio sono considerati di eccellente qualità. Lo studio ha confermato con successo la capacità degli ASC di formare grandi colonie in vitro, ha identificato le loro potenti capacità immunosoppressive e ha verificato l'espressione di diversi recettori MSC. Allo stesso modo, Seo et al. [102], precedentemente isolati, coltivati e parzialmente caratterizzati e definiti ASC, utilizzando l'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS), l'immunofenotipizzazione e l'immuno-colorazione. La qualità di questo studio è considerata equa, tuttavia, è importante interpretare attentamente molti dei loro risultati a causa di alcune limitazioni e risultati inaspettati. Ad esempio, gli ASC sorprendentemente non hanno espresso i marcatori Abcg2, CD90, AP, Nanog e SSEA1 [102]. Inoltre, a causa dell'attuale limitata disponibilità di marcatori di cellule staminali, in questo esperimento sono stati utilizzati vari anticorpi animali-specifici e umani dell'ospite, invece di anticorpi specifici del cervo [102]. Si suggerisce che per i futuri studi di caratterizzazione dell'ASC e per verificare l'identificazione dell'ASC, gli anticorpi delle specie di cervo-ospite dovrebbero essere sviluppati e utilizzati [102]. I PPC esprimono i classici marcatori mesenchimali, CD73, CD90, CD105 e Stro-1, e sembrano avere alcune caratteristiche ESC, tra cui l'espressione di Tert, Nestin, S100A4, nucleostemina e C-Myc, indicando il loro potenziale per la rigenerazione del tessuto dei mammifero. Ulteriori risultati in vitro hanno dimostrato che i PPC esprimono geni di pluripotenza, Oct4, Sox2 e Nanog, e potrebbero subire una differenziazione verso linee di cellule mesenchimali (osteo-, condro- e adipocyte) e neurali [70]. I PPC sembrano avviare la formazione di centri di crescita e influenzare lo sviluppo dei componenti tissutali sia esterni (nervi, vasi sanguigni e pelle) che interni (cartilagine e ossea) del corno rigenerante [59];. I centri di crescita sono a forma di mezzaluna e sono costituiti da fasci di cartilagine ricoperti da uno strato di pericondro, che formano la trave principale e il primo dente della corna [59];. Gli esperimenti di cancellazione e inserimento hanno dimostrato l'importanza dei PP (e dei PPC) per la rigenerazione annuale delle corna; [59]. Ad esempio, la rimozione chirurgica della membrana PP prima della rigenerazione ha inibito la ricrescita delle corna, indicando che i PPC sono essenziali per l'inizio della rigenerazione delle corna e la successiva formazione di tessuto osseo e cartilagine [59]. Gli esperimenti di delezione PP completa e parziale condotti da Li et al., hanno indicato che il basso rischio potenziale di errore è in parte dovuto a significative sfide tecniche associate agli esperimenti di delezione e trapianto di tessuto. Lo studio ha selezionato una dimensione del campione moderata di otto cervi (quattro cervi di un anno e quattro cervi di 2 anni), tuttavia sono indicati ulteriori studi con un numero maggiore di cervi a causa dell'incoerenza e della variabilità dei risultati. Ad esempio, la cancellazione completa della membrana PP in alcuni cervo ha ritardato la rigenerazione, mentre in altri ha inibito completamente la rigenerazione delle corna. Sono necessarie ulteriori ricerche per sviluppare l'immenso potenziale dei PPC per applicazioni mediche rigenerative.

Diversi studi in vitro hanno dimostrato che gli ASC passano attraverso vari stati di attivazione (dormante, attivo e post-attivo), durante fasi distinte della rigenerazione del tessuto delle corna di cervo. L'indagine critica e l'accumulo di prove sull'attivazione e la regolazione degli ASC indicano che l'attivazione delle cellule staminali potrebbe essere essenziale durante la ricrescita delle corna. Si pensa che l'attivazione e la differenziazione dell'ASC siano indotte e mantenute da diversi sistemi biologici e vie di segnalazione. Pertanto, la rigenerazione delle corna offre un'eccezionale opportunità per studiare il controllo proteomico delle nicchie di cellule staminali derivate neurali durante la rigenerazione degli organi. Un recente studio in vitro ha utilizzato la quantificazione senza etichette e l'analisi della via dell'ingegno (IPA) per indagare la regolazione dell'attivazione dell'ASC esaminando l'espressione proteica specifica in situ ottenuto PP dormiente, ASC attivati all'interno dell'AGC, cellule del periosteo facciale e AP post-attivato del fascio medio [24]. I risultati immunoistochimici di questo studio indicano che molti marcatori mesenchimali unici come CD73, CD90 e CD105 sono discerniti nei tessuti RM, PC e C all'interno della punta delle corna e sovraregolati durante specifici periodi di rigenerazione, controllando successivamente l'attivazione dell'ASC [24]. Anche l'Ippomo e la segnalazione canonica Wnt sono considerati i primi candidati per mediare l'attivazione ASC. La qualità complessiva e la validità esterna dei risultati ottenuti dallo studio Dong et al. [24], sono considerate sufficienti ma non riflettono interamente i valori veri. Ciò è dovuto a cambiamenti nella nicchia delle cellule staminali delle corna durante l'isolamento e la coltura di ASC in vitro, che influenzano l'espressione proteica [24]. Per verificare questi risultati, i futuri studi in vitro potrebbero essere progettati con condizioni di coltura progettate per ricreare il microambiente in vivo.

Applicazione clinica e potenziale terapeutico degli ASC

Nella biologia delle cellule staminali e nella medicina rigenerativa, diverse cellule staminali isolate da una varietà di grandi animali come cavalli e maiali, sono molto ricercate [102]. Le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono considerate il "gold standard" nelle terapie rigenerative basate sulle cellule, tuttavia, ci sono molte sfide significative per la traduzione clinica [55]. La recente identificazione e le caratterizzazioni molecolari parziali degli ASC nelle corna di cervo e il loro potenziale speculato ad ampio raggio per l'applicazione terapeutica nella medicina rigenerativa e nella ricerca sulle ossa/osteoporosi hanno suscitato un vivo interesse tra medici e scienziati [102];. Gli ASC isolati, come i PPC, sono unici e potrebbero fornire una nuova fonte di cellule staminali [102]. A differenza di altri tipi di cellule staminali, le ASC sono considerate vantaggiose a causa del loro facile isolamento, dell'elevata capacità proliferativa e di differenziazione e dell'espansione ex-vivo [95.102]. Recenti studi preclinici in vivo mostrano risultati promettenti indicando che le ASC non sono specifiche per specie animale e possono stimolare la guarigione delle ferite cutanee e ridurre la fibrosi epatica nei modelli di ratti [94]. Entrambi gli studi di Rong et al. [94,95], testati su modelli animali adatti, hanno presentato un discreto livello di prove, un'esplorazione elementare degli interventi e hanno inoltre fornito una solida base per una potenziale traduzione clinica. Tuttavia, le ASC sono eterologhe per l'uomo e non possono essere somministrate direttamente per iniezione [22]. Inoltre, l'efficacia delle terapie basate su cellule ASC in vivo modelli di ratti non garantisce il successo della sua somministrazione nei pazienti umani. Questi esperimenti preclinici sugli animali rimangono ancora controversi in quanto non possono essere utilizzati come mezzo per prevedere l'efficacia o la sicurezza degli ASC negli studi clinici. Pertanto, gli ASC non possono muoversi verso futuri studi sull'uomo senza un'analisi sistematica di tutti i dati preclinici degli studi sugli animali. Ad oggi, non ci sono dati esistenti da studi clinici sull'uomo sull'efficacia e/o sulla sicurezza di potenziali terapie rigenerative basate su cellule staminali derivate da corna o terapie combinate, in particolare per il rimodellamento osseo nei pazienti [102]. Prima del potenziale uso diffuso delle corna di cervo in un contesto clinico, è necessario uno sforzo concertato per espandere la nostra conoscenza degli ASC e dei potenti sistemi di regolazione che controllano il processo di rigenerazione delle cellule staminali del corno. Ciò è dovuto alla quantità e alla qualità inadeguate degli studi sugli ASC, e quindi ulteriori studi preclinici sui modelli animali sono essenziali [102]. Inoltre, sono necessari studi comparativi che contrappongono le ASC a varie cellule umane, come le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) [42]. Inoltre, identificare e superare le barriere nella traduzione degli ASC nella clinica in una fase iniziale è considerato cruciale e di grande dovere per la società.

Nonostante il corno di cervo sia riconosciuto come un modello sperimentale adatto per la rigenerazione del tessuto scheletrico e una promettente strategia terapeutica per la malattia umana, ci sono molti vincoli verso la sua più ampia applicazione e uso clinico [92]. In primo luogo, i trattamenti per il trapianto di cellule staminali xenogenee sono controversi, sollevando importanti preoccupazioni etiche e legali [95]. Queste preoccupazioni preliminari includono i diritti degli animali, l'intervento dell'uomo con la natura, la potenziale introduzione di agenti patogeni nell'uomo, l'ottenimento del consenso informato del paziente e la combinazione di cellule/geni umani e animali. In secondo luogo, c'è una profonda variabilità tra il tessuto scheletrico umano e i tessuti delle corna, e importanti differenze nella loro durata di vita, che potrebbero potenzialmente portare a un funzionamento fisiologico errato [113]. In terzo luogo, l'applicazione clinica degli ASC presenta un rischio per la sicurezza ed è limitata dal rischio di rigetto immunitario, sensibilità in condizioni tossiche, senescenza e bassa disponibilità [44]. Anche gli effetti a lungo termine delle cellule staminali trapiantate non sono chiari e richiedono un'ampia ricerca. Ulteriori carenze includono il potenziale uso rigoroso di un organismo grande, selvaggio, non modello, che è di grande importanza ecologica e complessità [92]. La rigenerazione delle corna sembra essere iniziata stagionalmente, da livelli sistemici di ormoni riproduttivi, anziché essere indotta da lesioni o traumi, che limita il loro uso nella ricerca e nella medicina rigenerativa [92].

Fattori di crescita e vie di segnalazione che regolano la rigenerazione del tessuto del corno

I fattori di crescita e le vie di segnalazione cellulare che controllano la ricrescita delle corna sono in gran parte sconosciuti. Sia i fattori locali che quelli sistemici sono stati collegati alla rigenerazione delle corna e si pensa che i meccanismi molecolari che influenzano la crescita delle corna siano simili a quelli coinvolti nella regolazione dello sviluppo embrionale [31]. La ricrescita delle corna è legata al ciclo riproduttivo e sembra essere regolata sistematicamente dagli ormoni sessuali, compresi il testosterone e gli estrogeni (Tabella 1). Ulteriori fattori sistemici, come la vitamina D, il calcio e la melatonina, sembrano influenzare la crescita delle corna [108];. A livello locale, sono stati trovati numerosi fattori di crescita per regolare i processi cellulari di rigenerazione delle corna, come PTHrP, RA e IGF-1 [106];. Pertanto, sembra esserci una serie di ormoni della crescita che influenzano la rigenerazione delle corna, e qui esploriamo i possibili elementi genetici, i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione che mediano i loro effetti.

Tabella 1. Ormoni, fattori di crescita e vie di segnalazione che mediano la rigenerazione del tessuto delle corna.

Ormoni, fattori di crescita e vie di segnalazione

Ruolo nella rigenerazione del tessuto delle corna

Riferimento

Testosterone
  • •
    Il regolatore predominante della tempistica del rinnovo delle corna.

[32]

Estrogeno
  • •
    Limita la proliferazione delle cellule progenitrici e promuove la sua differenziazione all'interno della punta delle corna.

[90]

IGF-1
  • •
    Interagisce con il testosterone per influenzare l'intensa crescita delle corna.

    •
    Proliferazione degli ASC nella punta delle corna

[106]

Segnalazione Wnt canonica
  • •
    apoptosi RMC e sopravvivenza

    •
    Regola la formazione ossea osteoblastica e la condrogenesi

[80]

Melatonina (MLT)
  • •
    Aumenta la segnalazione IGF-1/IGF-1R

    •
    Promuove la proliferazione delle cellule mesenchimali del corno

[119]

Peptide correlato all'ormone paratiroideo (PTHrP)
  • •
    Regolatore della differenziazione di osteoblasti, condrociti e osteoclasti.

    •
    Controlla l'auto-rinnovo e la tempistica dei condrociti.

[21]

Acido retinoide (RA)
  • •
    Controlla la differenziazione di condrociti, osteoblasti e osteoclasti.

[90]

La ricrescita annuale delle corna di cervo maschio è cronometrata per coincidere con il ciclo riproduttivo e si pensa sia regolata da livelli sistemici di ormoni riproduttivi [32.105];. Il testosterone sembra essere il principale regolatore della tempistica della crescita delle corna, tuttavia, è probabile che la crescita intensa delle corna sia influenzata dall'interazione di numerosi ormoni, come l'estrogeno, l'ormone che rilascia la gonadotropina (GnRH), l'ormone luteinizzante (LH), il cortisolo e la prolattina [7,32]. Degli ormoni riproduttivi, l'estrogeno sembra limitare la proliferazione delle cellule progenitrici e promuovere la loro differenziazione nella punta del corno. Inoltre, l'interazione dei fattori di crescita, come l'IGF-1, con il testosterone, è costantemente trovata influenzare l'intensa crescita delle corna di cervo in vivo [7,106]. I risultati istologici autoradiografici supportano la nozione che l'IGF-1 è un fattore endocrino coinvolto nella regolazione della crescita delle corna di cervo per interazione con il testosterone [26,27]. Sono necessarie ulteriori ricerche per migliorare la nostra comprensione dei ruoli precisi, dei tempi e delle interazioni degli ormoni riproduttivi e dei fattori di crescita nella regolazione della crescita ciclica delle corna di cervo.

Il peptide correlato all'ormone paratiroideo (PTHrP) sembra avere effetti locali sulla crescita delle corna di cervo. Nell'uomo, la segnalazione PTHrP tramite il suo recettore, il recettore PTH di tipo 1 (PTHR1 o PPR), è considerata per regolare lo sviluppo scheletrico, il metabolismo osseo e l'omeostasi degli ioni minerali [18]. Gli studi classici su animali e in vitro indicano che la PTHrP coordina il processo di ossificazione endocondrale durante lo sviluppo scheletrico regolando la differenziazione dei condrociti [21,58,109]. Il PTHrP media gli effetti di IHH sui condrociti da un ciclo di feedback negativo autocrino/paracrino [109], che influenza il tasso e la tempistica della differenziazione dei condrociti e la differenziazione degli osteoblasti della piastra di crescita [21]. Le mutazioni che portano alla disregolazione della segnalazione PTHrP/PTHR1 sono note per causare disturbi scheletrici, come le concondordisplasie [100]. Ricerche successive indicano che il PTHrP regola la proliferazione, la differenziazione e la maturazione dei condrociti sia attraverso la segnalazione mediata dal recettore che direttamente per traslocazione nucleolare [3]. Nelle corna di cervo, i risultati in vitro indicano che il PTHrP potrebbe regolare la differenziazione di osteoblasti, condrociti e osteoclasti. L'ibridazione in situ e i risultati immunoistochimici indicano che il PTHrP può promuovere la proliferazione e influenzare la tempistica della differenziazione dei condrociti, portando alla regolazione della crescita delle corna [4,100]. Successivi studi di ibridazione in situ indicano che il PTHrP sembra attenuare la differenziazione, la maturazione e la degradazione della matrice cartilaginea dei condrociti inibendo l'espressione delle metalloproteinasi della matrice, MMP9 e MMP13 [113]. Durante il periodo di rapida crescita delle corna si pensa che la segnalazione PTHrP/PPR regoli la differenziazione sia degli osteoblasti che delle cellule osteoclaste all'interno dei tessuti perivascolari della cartilagine delle corna. La segnalazione PTHrP/PPR sembra essere unica per il suo effetto diretto sulla differenziazione degli osteoclasti durante la rigenerazione delle corna di cervo, per cui PPR sembra essere localizzato al nucleo e PTHrP può influenzare l'osteoclastogenesi indipendentemente da RANKL [29]. È interessante notare che l'asse di segnalazione PTHrP/IHH/TGF-β dell'ossificazione endocondrale sembra essere conservato durante la ricrescita delle corna di cervo [31], per cui le vie di segnalazione dello sviluppo influenzate da IHH e TGF-β possono formare un ciclo di feedback negativo PTHrP/PPR per la regolazione della rigenerazione ossea e della cartilagine. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per studiare gli effetti unici e i meccanismi di segnalazione del PTHrP coinvolti nella regolazione dei processi cellulari che controllano la rigenerazione delle corna di cervo.

L'acido retinoide, RA, è un metabolita ormonale attivo del retinolo (vitamina A, o all-trans-retinolo) che svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale dei vertebrati e nella formazione degli organi, come l'occhio. Un certo numero di studi suggeriscono l'importanza dell'AR per la rigenerazione degli arti negli anfibi, ad esempio, l'analisi basata sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni della rigenerazione degli arti dell'assolotl ha chiarito l'effetto di un gradiente di RA anteroposteriore, che è coinvolto nella modellazione dell'arto [99]. Le prove istologiche, immunolocalizzate e ibridazioni in situ indicano che l'AR è sintetizzata e i suoi recettori sono espressi nel blastema e nelle MSC delle corna di cervo in via di sviluppo. Ulteriori risultati in vitro supportano gli effetti dell'AR sulla regolazione della differenziazione di condrociti, osteoblasti e osteoclasti durante la ricrescita delle corna di cervo, tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per determinare i meccanismi di segnalazione cellulare precisi e le vie molecolari che mediano questi effetti. Ulteriori prove di cromatografia liquida ad alte prestazioni, immunoistochimica e ibridazione in situ suggeriscono che l'AR è coinvolta nella regolazione della rigenerazione delle corna di cervo [3]. L'AR è risultato essere significativamente espressa dai tessuti delle corna di cervo, tra cui la pelle, il pericondro, l'osso, la cartilagine e il periosto [3]. I recettori per l'AR delle famiglie del recettore dell'acido retinoico (RAR) e del recettore retinoide X (RXR) sono tipicamente espressi all'interno dell'area della punta dell'arna che subisce la crescita per ossificazione endocondrale, compreso il velluto e il pericondro, e le cellule del condrocito e dell'osteoblasto [3]. Inoltre, l'immunolocalizzazione della retinaldeide deidrogenasi di tipo 2 (RALDH-2), un enzima primario della sintesi dell'AR, ha rilevato la sua espressione all'interno della pelle, del pericondro e delle cellule perivascolari, comprese le cellule di condrociti e osteoblasti [3]. Successivi risultati in vitro indicano che l'AR può inibire la differenziazione dei condrociti e promuovere la differenziazione degli osteoblasti, suggerendo la necessità di ulteriori indagini [3]. È stato anche riscontrato che il trattamento con RA aumenta la crescita del peduncolo e le dimensioni delle prime corna nei cervi, e sono necessarie ulteriori ricerche sulla risposta cellulare del pericondrio per determinare i meccanismi di questo effetto [48]. Insieme questi risultati suggeriscono che l'AR regola la rigenerazione ciclica delle corna di cervo e ulteriori ricerche aiuteranno a determinare il potenziale dell'AR per le relative applicazioni mediche rigenerative.

Wnt ("tipo senza ala") sono una grande famiglia di geni che sono conservati dall'evoluzione e codificano numerose proteine tra le specie (circa 19 nell'uomo), per la regolazione dei processi biologici vitali di sviluppo embrionale [56,85,116]. La segnalazione Wnt colpisce diversi processi di embriogenesi, tra cui il modello, la formazione degli organi e lo sviluppo dei sistemi e il destino cellulare [56]. La segnalazione Wnt è mediata da complesse vie intracellulari che portano alla regolazione della trascrizione genica all'interno del nucleo, e oggi, la nostra conoscenza delle complessità delle vie Wnt continua ad evolversi [116]. Si ritiene che la segnalazione Wnt sia attivata dal legame delle proteine Wnt ai recettori transmembranali di superficie, chiamati Frizzled o Fz (una famiglia di circa 10 nell'uomo), con coattivazione di recettori, come la proteina a bassa densità legata alle lipoproteine 5/6 (LRP5/6) [43,56]. Dopo il legame Wnt, l'attivazione del complesso recettore sembra effettuare la trasduzione del segnale alla fosfoproteina, Dishevelled (Dsh/Dvl), all'interno del citoplasma, dove può ramificarsi lungo una delle tre vie accettate: Wnt canonica, polarità cellulare planare non canonica e Wnt/Ca2+ non canonica [56,110]. La segnalazione canonica Wnt è classicamente mediata dalla traslocazione della β-catenina al nucleo per la regolazione della trascrizione genica e sembra essere fondamentalmente importante per l'omeostasi ossea, regolando la formazione ossea osteoblastica e l'osteoclastogenesi per il rimodellamento osseo [11,116,120]. La segnalazione Wnt (Wnts 10a, 7a, 5a e 5b) sembra anche regolare la rigenerazione delle strutture perse nei vertebrati inferiori, come la coda degli anfibi urodele [16]; e la segnalazione Wnt è stata studiata per il suo potenziale ruolo nella regolazione della rigenerazione delle corna di cervo. L'immunocitochimica e i risultati in vitro indicano che la segnalazione canonica Wnt tramite β-catenina sembra essere cruciale per la sopravvivenza, e possibilmente l'apoptosi, delle ASC all'interno del tessuto mesenchimale delle corna in crescita e potrebbe regolare la formazione ossea endocondrale e intramembranosa da parte di osteoblasti e condrociti in modo specifico del tessuto. Lo studio Mount et al. è considerato nuovo, ben progettato e condotto, fornendo una solida base di prove con conclusioni valide. Tuttavia, è importante riconoscere che la localizzazione della β-catenina per l'indagine della segnalazione canonica Wnt può potenzialmente avere un impatto sulla validità dei risultati, poiché si ritiene che l'espressione della β-catenina sia influenzata da molti meccanismi indipendenti da Wnt. Recentemente, la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata utilizzata per rilevare l'espressione di microRNA (miRNA) all'interno degli ASC di cervo da PP [4]. Wnt, insieme alla proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) e al TGF-β, era una delle 167 famiglie di miRNA conservate e 20 specifiche del cervo che sembrano essere sovraregolate per l'inizio del potenziamento dell'ASC all'interno del PP durante la rigenerazione delle antile [4]. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire la complessa rete di regolazione e gli effetti della segnalazione Wnt coinvolta nella regolazione dei processi cellulari, compresa la formazione ossea osteoblastica e la condrogenesi, specifica per la rigenerazione delle corna di cervo. Lo studio di Ba et al. [4], sembra essere di buona qualità, poiché il documento ha stimato in modo accurato e quantitativo i profili di espressione di miRNA dei PPC durante gli stadi potenziati (PPP) e dormienti (DPP) della rigenerazione delle corna. Si coerisce e si estende su una serie di studi precedenti e ha inoltre utilizzato una dimensione del campione appropriata di sei tessuti ottenuti da tre cervi sika maschi [4]. Questa dimensione del campione selezionata ha permesso la replicazione biologica, che ha migliorato l'affidabilità dei risultati RNA-seq.

La melatonina (MLT) è un ormone secreto dalla ghiandola pineale del cervello nell'uomo e si ritiene che influenzi la tempistica dei ritmi circadiani in risposta all'oscurità. Nei cervi, la melatonina sembra influenzare il ciclo riproduttivo e l'inizio della stagione riproduttiva, anche a seconda dell'oscurità, e potrebbe regolare la crescita e la rigenerazione delle corna [1,14,74,115]. Il meccanismo della segnalazione del recettore MLT/melatonina 1 (MT1) per la regolazione delle cellule mesenchimali del corno di cervo è stato studiato in vitro. Si pensa che MT1 sia espresso dallo strato di cambio del corno di cervo ed è stato rilevato nelle cellule mesenchimali delle corna. Inoltre, la MLT esogena ha portato alla proliferazione delle cellule mesenchimali tramite la segnalazione MT1 e la MLT sembrava anche aumentare la segnalazione IGF-1/IGF-1R, indicando un possibile meccanismo di co-attivazione della segnalazione IGF-1/IGF-1R da parte di MLT per la proliferazione delle cellule mesenchimali antler. Tuttavia, i risultati in vitro riportati da Yang et al., sembrano essere inconcludenti, il che sminuisce l'affidabilità e la qualità dello studio. La localizzazione dei recettori MLT è stata studiata e determinata, tuttavia, non è accurata né indicativa della piena funzione potenziale della MLT nella rigenerazione. Ulteriori ricerche hanno rilevato polimorfismi a singolo nucleotide del recettore della melatonina 1A (MT1A), che possono aumentare la resa delle corna [119]. Pertanto, la MLT sembra influenzare la regolazione della rigenerazione delle corna di cervo e sono necessarie ulteriori indagini per determinare in modo completo i suoi potenziali meccanismi e l'applicabilità terapeutica.

Base genetica della rigenerazione delle corna e della resistenza al cancro

La rigenerazione delle corna è considerata un processo rigenerativo epimorfico basato sulle cellule staminali della cresta neurale;. Attualmente si sa poco sui geni che regolano la rapida crescita dei tessuti osservata nelle corna di cervo, e studi recenti hanno utilizzato la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione per analizzare le basi genomiche della rigenerazione delle corna di cervo [5,113];. Inoltre, i rapidi tassi di crescita osservati nelle corna (in eccesso rispetto a determinati tumori) e il basso tasso di cancro delle cervidi, indicano che distinti processi genetici inibitori oncogenici della rigenerazione delle corna di cervo possono fornire indizi per l'attenuazione basata sui geni e il trattamento dei tumori umani. A seguito dell'analisi transcriptomica di 221 genomi di cervidi e bovidi, la presenza di copricapo (corna e corna) è caratterizzata da elementi genetici definiti, definiti geni selezionati positivamente specifici del lignaggio ed elementi conservati (HCE), tra cui 761 geni specifici per le corna e 201 condivisi. I geni distintamente espressi nelle corna e nelle corna (geni degli copricapo) sono spesso co-espressi all'interno dei tessuti del nervo, dei testi, dell'osso e della pelle. Si ritiene che le corna derivino dalle cellule staminali della cresta neurale e, da una prospettiva evolutiva, i risultati di questo studio suggeriscono che i geni associati a HCE specifici per copricapo, TWIST1, SOX9, SNAI2 e il cluster HOXD possono essere coinvolti nella riprogrammazione delle cellule della cresta neurale per lo sviluppo di copricapo (Tabella 2) [9];. Inoltre, i geni specifici per copricapo includevano geni correlati alla migrazione delle cellule della cresta neurale e geni coinvolti nei processi neurali di rigenerazione delle corna (SOX10, SNAI1, SNAI2, TFAP2A, NGFR e COL11A2). Nove geni altamente espressi in copricapo come rilevato da questo studio (ALX1, VCAN, COL1A1, SATB2, RUNX2, POSTN, SP7 o OSX, TNC e COL4A2) sono classificati come geni dello sviluppo osseo per ontologia genica (GO) [19];. Si ritiene che il set di dati di questo studio genomico e trascrittomico in vitro su larga scala sia di eccellente qualità e grande affidabilità statistica. Ciò è indicato dalla grande dimensione del campione di 16 tessuti, che sono stati ottenuti da 20 caprioli e 20 cervi sika, comprese le analisi comparative dei profili genetici sia dei bovidi che dei cervidi all'interno del gruppo dei mammiferi ruminanti. Negli studi futuri, la combinazione di analisi funzionali, fisiologiche e trascrittomiche con un'ampia gamma di campioni attraverso i vari periodi di rinnovamento delle corna è necessaria per verificare la funzione dei geni neurali specifici delle corna identificati. SP7 (chiamato anche OSX) è un fattore di trascrizione noto per il suo ruolo nella regolazione della differenziazione degli osteoblasti e nella formazione ossea [82]. L'espressione genica RUNX2 è un affermato promotore dell'osteogenesi e regolatore della trascrizione OSX [34.84]. Ulteriori risultati basati sul modello RNA-seq in vitro hanno identificato il coinvolgimento unico di geni precedentemente sconosciuti nella proliferazione delle corna di cervo (40) e nella mineralizzazione (91), tra cui UHRF1 e S100A10 [113]. Questo studio semplicistico e su scala più piccola è stato il primo a identificare geni unici che si esprimono nel corno rigenerante, e sembra essere di buona qualità. Inoltre, i set di dati RNA-seq comprendono una grande percentuale di geni non annotati, che potrebbero essere raffinati utilizzando la mappatura delle rastriche guidata dall'ortologia [113]. Sono suggeriti ulteriori miglioramenti allo studio che potrebbero potenziare il suo impatto e perfezionare la replica futura di questa ricerca [113]. Insieme questi risultati forniscono un'ampia caratterizzazione, suggerendo che la rigenerazione delle corna di cervo è regolata da una rete di centinaia e migliaia di geni e HCE, che è definita in modo incompleto. Pertanto, è necessaria un'ulteriore indagine delle complesse reti di regolazione genetica, delle vie di segnalazione molecolare e dei loro risultati biologici che influenzano la crescita, lo sviluppo e la rigenerazione delle corna di cervo.

Tabella 2. Il controllo genetico della rigenerazione del tessuto delle corna.

Gene

Funzione genetica e/o ruolo nella rigenerazione delle corna

Riferimento

SNAI2, cluster HOXD, TWISTI1, SOX9

Migrazione delle cellule staminali della cresta neurale

[111]

OLIG1, OTOP3, COL11A2

Differenziazione delle cellule staminali della cresta neurale

[111]

FOXD3, SOX10, SNAI1, TFAP2A, NGFR

geni delle cellule staminali della cresta neurale

[111]

ALX1, VCAN, COL1A1, SATB2, RUNX2, POSTN, SP7, COL4A2

Sviluppo osseo

[111]

NGFR

Crescita neurale

[111]

RXFP2, SOX10

Funzione neurale

[111]

UHRF1

proliferare delle cellule ossee

[112]

S100A10

Mineralizzazione ossea

[112]

TP73, TP53I13

Inibizione della crescita tumorale

[111]

ELOVI6, S100A8, ISG15, CNOT3, CCDC69

Regolazione della divisione cellulare e inibizione della crescita del tumore

[111]

ADAMTS18

Inibizione della crescita tumorale mediante regolazione del microambiente tumorale

[111]

RXFP2

Gene specifico per copricapo

[111]

FGF19, FGF21, FGFBP3, PDGFD, PDGFRL

proliferare e sopravvivenza delle cellule tumorali

[111]

S100A4

Espresso in ASC

proliferare cellulare e crescita tumorale

[62]

NOVA1

Crescita tumorale e attivazione della telomerasi

[111]

FOS, REL, FAM83A

Proto-oncogene

FOS = proliferazione e differenziazione cellulare

FAM83A = Via di segnalazione EGFR

[111]

Nonostante i rapidi tassi di crescita osservati nelle corna di cervo, il tasso di cancro nei cervidi è stato riportato come relativamente inferiore rispetto ad altri mammiferi, portando i ricercatori a cercare spiegazioni per le basi biologiche di questo paradosso [35,75]. La rapida crescita delle corna è essenzialmente guidata dai processi di proliferazione cellulare, formazione di ossa e cartilagine, e i profili di espressione genica delle corna e dell'osteosarcoma sono più altamente correlati di quelli delle corna e dell'osso normale. Inoltre, i programmi di proliferazione cellulare delle corna hanno somiglianze con quelli della crescita delle cellule tumorali, tuttavia, a differenza dei tumori tumorali la cui rapida crescita è incontrollata e patologica, la rigenerazione del tessuto delle corna è un processo fisiologico altamente coordinato. Recenti risultati hanno rilevato la selezione positiva di proto-oncogeni (FOS, FAM83A e REL) nei cervidi durante l'evoluzione e l'espressione specifica del corno di cinque fattori di crescita e geni recettori (FGF19, FGF21, FGFBP3, PDGFD e PDGFRL), che sono implicati nello sviluppo del cancro [107];. Recenti risultati indicano anche che la resistenza al cancro delle corna sembra essere regolata da geni soppressori del tumore. I geni soppressori del tumore che sono selezionati positivamente nei cervidi e altamente espressi nelle corna includono PML, TP53-via-related e membri della famiglia ADAMTS, come ADAMTS18 [46,47,87];. Inoltre, tre geni del cofattore p53 (PML, NMT2 e CD2AP) e cinque geni regolatori p53 (ELOVL6, S100A8, ISG15, CNOT3 e CCDC69) sono risultati selezionati positivamente nei cervidi ed espressi nelle corna. È interessante notare che i geni specifici delle corna della famiglia ADAMTS hanno livelli di espressione più elevati nelle corna di cervo che nell'osteosarcoma. Inoltre, i geni TP73 e TP53I13 sono espressi distintamente nelle corna e possono inibire la crescita del tumore attraverso la via di risposta al danno al DNA mediata da p53 [77];. La risposta al paradosso della rigenerazione delle corna di cervo sembra quindi essere spiegata dalla rete di regolazione del gene soppressore del tumore. Sono necessarie ulteriori ricerche per dimostrare i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione che regolano la profonda proliferazione cellulare e la differenziazione unica per le corna di cervo, fornendo al contempo resistenza al cancro.

Origine evolutiva della rigenerazione nelle corna di cervo

Le corna sono un adattamento affascinante ed elaborato che si pensa si sia evoluto per selezione naturale per l'uso da parte dei cervi maschi come armi, per l'esposizione e la competizione, e per la difesa contro i predatori [12,36,76]. Nei cervi la dimensione e la simmetria delle corna possono servire come indicatore di forza e gerarchia, determinando in definitiva l'idoneità e il successo riproduttivo [17]. Inoltre, si pensa che alcune specie, come l'alce irlandese, abbiano subito l'estinzione a causa delle sproporzioni tra le dimensioni delle corna e la massa corporea [78]. Recenti scoperte mostrano che la morfologia delle corna di cervo può essere prevista dalla filogenesi e dalla massa corporea [15]. Gli studi filogenetici sull'evoluzione delle corna di cervo hanno fornito una preziosa comprensione di questo argomento, che rimane un'area di contesa scientifica.

Le appendici craniche ossee, come le corna di cervo (nei cervidi), sono una forma di copricapo dei ruminanti, comprese anche le corna (bovidi), le corna (antilocapridi) e gli ossiconi (giraffidi), che sembrano evolversi nelle famiglie di Pecora durante il Neocene, circa 23,3-20,8 milioni di anni fa [19,23]. Le caratteristiche morfologiche robuste comuni del copricapo dei ruminanti includono la loro prescienza nei maschi, l'accoppiamento e il posizionamento sull'osso frontale, un nucleo osseo, coperto dalla pelle e dai relativi tessuti connettivi [23]. Le corna si trovano solo nei cervidi e sono appendici di mammiferi unici che vengono rigenerati annualmente [23,36]. Inoltre, l'origine evolutiva dei copricapo dei ruminanti rimane una questione di attuale vigoroso dibattito, cercando di spiegare, ad esempio, la variazione morfologica del copricapo tra le famiglie di Pecora: può essere definita una singola origine ancestrale comune del copricapo dei ruminanti o il copricapo dei ruminanti si è evoluto indipendentemente da più antenati? Le sfide nel determinare l'origine del copricapo sono considerevoli e derivano dalle discrepanze tra gli alberi filogenetici e dai risultati confondenti degli studi sullo sviluppo del copricapo [23]. Gli alberi filogenetici, i registri fossili e il profilo del trascrittoma hanno indicato che il copricapo dei ruminanti potrebbe aver avuto origine da un singolo antenato di Pecora e successivamente diversificato, tuttavia, la complessità dei modelli e le incongruenze della filogenesi contraddicono una teoria unificata per spiegare l'evoluzione del copricapo [19], indicando quindi la necessità di ulteriori ricerche.

Riepilogo

Anche se i biologi hanno fatto notevoli progressi nell'ultimo decennio, c'è ancora una scarsità di conoscenza nei meccanismi cellulari e nelle vie molecolari che governano il rinnovamento delle corna. Questo è sorprendente dato l'enorme valore che le corna di cervo detengono come unico modello di rigenerazione degli organi dei mammiferi. Una grande svolta nella ricerca sulle corna è derivata dalla scoperta e dalle caratterizzazioni molecolari di nuovi ASC, cellule che sembrano assomigliare molto agli ESC. Questa scoperta ha drasticamente spostato la nostra precedente comprensione della rigenerazione delle corna, che una volta si pensava fosse paragonabile a quella della rigenerazione degli arti negli anfibi urodele. I progressi scientifici nelle tecnologie di sequenziamento del genoma hanno permesso la recente identificazione di diversi geni specifici per le corna che sono coinvolti in questa rapida crescita longitudinale. Esiste inoltre l'eterogeneità nella qualità della letteratura, con molte delle prove pubblicate considerate inaffidabili e possibilmente fuorvianti. Quindi, è importante che gli studi siano interpretati con cautela. Per formulare risultati precisi e validi, la ricerca futura deve sforzarsi di fornire prove di qualità superiore da studi ben progettati ed eseguiti, per lo sviluppo della potenziale applicazione sicura ed efficace di ASCS per uso terapeutico. La sfida futura nel campo è decifrare come questi fattori ambientali ed endocrini, ad esempio il testosterone, interagiscono con i fattori locali per orchestrare la rigenerazione delle corna. Inoltre, una comprensione delle interazioni tra le varie vie di segnalazione e dei meccanismi che regolano la crescita delle prime corna può fornire ulteriori intuizioni fondamentali sul rinnovamento delle corna. In conclusione, è stato anche suggerito che la ricerca approfondita sulla guarigione delle ferite delle corna sia utile per l'applicazione nella diminuzione delle cicatrici durante il processo di guarigione delle ferite umane.

Contributi dell'autore

M.F. ha contribuito ideando e scrivendo la bozza originale. S.B. ha rivisto e modificato criticamente il manoscritto. J. C., X. H. e D.W. hanno fornito discussione, consigli e punti di revisione durante il processo di formazione del documento di revisione. D.W. e J.X. hanno discusso e formulato l'idea. J.X. ha coordinato questa revisione e il manoscritto rivisto.

Dichiarazione di disponibilità dei dati

I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta ragionevole.

Dichiarazione di interesse concorrente

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto in parte dall'Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC, APP1107828, APP1127156, APP1163933). Dr. Jiezhi Chen riceve un titolo di visiting scholar alla UWA. Dr. Desmond Williams detiene un professore consultivo ad hoc presso la Divisione di Biologia Rigenerativa e fornisce tessuti di corna di cervo nel corso di questo studio.

 

Riferimenti

 

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